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Proteína Biotinilada
La interacción entre la biotina y la avidina/estreptavidina (SA) es increíblemente fuerte y específica, lo que la convierte en una excelente herramienta en la bioquímica de proteínas. Sin embargo, la generación de proteínas biotiniladas de alta calidad presenta un gran desafío. Los investigadores a menudo se encuentran con problemas técnicos que incluyen etiquetado insuficiente, alta variación de lote a lote y rendimiento impredecible. Además, la elección de los métodos de biotinilación también afecta significativamente el resultado final. Cada proteína objetivo (ensayo) tiene sus propias características bioquímicas únicas y, por lo tanto, requiere una solución personalizada.
Estos factores de confusión dificultan que los laboratorios individuales fabriquen y usen conjugados de biotina, mientras que al mismo tiempo hay pocos productos disponibles comercialmente. Para llenar este vacío, ACROBiosystems ha desarrollado una colección exclusiva de proteínas recombinantes biotiniladas validadas experimentalmente y premarcadas. La colección de proteínas biotiniladas de Mabsol® incluye más de cien objetivos farmacológicos y proteínas biomarcadoras comúnmente estudiadas.
Utilizamos proteínas recombinantes de alta calidad que son más cercanas a la conformación natural y modificación como materiales de partida. Revisamos minuciosamente todas las opciones para lograr la máxima bioactividad y sensibilidad de detección.También aplicamos las medidas de control de calidad más estrictas posibles para garantizar variaciones mínimas de lote a lote.
La colección de proteínas biotiniladas Mabsol® incluye dos series de productos únicas y complementarias, la serie PrecisionAvi basada en Avitag™ tecnología(Ver lista completa) , y la serie UltraLys producida utilizando el método de etiquetado químico desarrollado internamente(Ver lista completa).Estos productos están hechos con toda la atención a los detalles.
Los productos de esta serie se fabrican exclusivamente con tecnología Avitag™. Brevemente, un péptido único de 15 aminoácidos, la etiqueta Avi, se introduce en la proteína recombinante durante la construcción del vector de expresión. El único residuo de lisina en la etiqueta Avi es biotinilado enzimáticamente por la biotina ligasa BirA de E. Coli.
Esta técnica de marcaje enzimático de punto único ofrece muchas ventajas para los ensayos de unión de uso común.
La biotinilación solo ocurre en el residuo de lisina de la etiqueta Avi.
NO hay interferencia con las actividades de unión natural de la proteína objetivo.
La orientación de la proteína es uniforme cuando se inmoviliza sobre una superficie recubierta de avidina.
Los productos de esta serie se fabrican utilizando nuestro enfoque de etiquetado químico desarrollado internamente. Las aminas primarias en las cadenas laterales de los residuos de lisina y el extremo N de la proteína se conjugan con biotinas, lo que generalmente da como resultado la unión de múltiples biotinas en una sola molécula de proteína.
Mayor sensibilidad de detección
Enfoque de etiquetado químico desarrollado internamente
La producción de nuestras proteínas recombinantes, incluidas las proteínas biotiniladas, se lleva a cabo utilizando nuestra plataforma de expresión patentada HEKMax®. Como anfitriones de expresión, las células HEK293 humanas tienen una variedad de ventajas en comparación con otros tipos de células, como se resume en la siguiente tabla.
La bioactividad de las proteínas biotiniladas está determinada tanto por la estructura de la propia proteína como por la forma en que se realiza la biotinilación. Para cada proteína individual, probamos múltiples opciones de etiquetas y métodos de biotinilación, y evaluamos los productos en una variedad de ensayos de unión. Solo aquellos con el mejor rendimiento son seleccionados para la producción. La Figura 1 es un ejemplo de nuestros experimentos de evaluación interna:
Fig. 1 Binding activity of different forms of biotinylated PD1 evaluated in a functional ELISA against rhPD-L1 (Cat. No. PD1-H5258).
Our biotinylated proteins demonstrate high bioactivity and superb detection sensitivity in different application. In functional ELISA, the biotinylated human TACI has high binding activity with BAFF as showed in Fig. 2. Interestingly, oriented immobilization of biotinylated CD155 offers much higher sensitivity than random immobilization of unconjugated CD155 as showed in Fig. 3. Fig.4 and Fig. 5 show that the biotinylated PD1 can be well applied to AlphaLISA to detect the binding activity with its ligand PD-L1 and PD-L2. The Fig. 6 and Fig. 7 show that the biotinylated protein can be easily used for determining the affinity between protein and therapeutic antibody in SPR assay. Also, the biotinylated proteins are often used in cell based assay, such as cytotoxicity assay and evaluation of CAR expression (Fig. 8 & Fig. 9).
Fig.2 Immobilized Human BAFF, Fc Tag, active trimer (Cat. No. BAF-H5261) at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human TACI, Fc,Avitag (Cat. No. TAI-H82F6) with a linear range of 0.002-0.05 μg/mL.
Fig. 3 Comparison of oriented immobilization (biotinylated CD155 on precoated streptavidin plate, Cat. No. CD5-H82E3) and random immobilization (unconjugated CD155 direct coating on 96-well plate, Cat. No. CD5-H5223)binding to TIGIT( Cat. No. TIT-H5254). Oriented immobilization of biotinylated CD155 offers much higher sensitivity than random immobilization of unconjugated CD155.
Fig. 6 Immobilized biotinylated human VEGF165 (Cat. No. VE5-H82Q0) on CM5 Chip via streptavidin, can bind Avastin with an affinity constant of 0.417nM as determined in SPR assay (Biacore T200).
Fig.7 Loaded Biotinylated Human PD-1, Avitag,His Tag (recommended for biopanning) (Cat. No. PD1-H82E4) on SA Biosensor, can bind Human PD-L1, His Tag (HPLC verified) (Cat. No. PD1-H5229) with an affinity constant of 2.4 μM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e).
Fig. 8 Recombinant human TNF-alpha (Cat. No. TNA-H82E3) induces cytotoxicity effect on the WEH1-13VAR cells in the presence of the metabolic inhibitor actinomycin D. The EC50 for this effect is 0.014-0.029 ng/ml. The result shows that the biotinylated human TNF-alpha is consistent with naked TNF-alpha in cytotoxicity assay.
We routinely apply rigorous quality control measures to ensure consistent performance of our products. Newly produced products are subjected to side-by-side comparison with our internal standard in a variety of assays. Only those within an acceptable margin of difference are allowed to be released. As demonstrated in Fig. 9, three different batches of biotinylated hTNF-alpha (Cat. No. TNA-H82E3) are tested and compared using a standard ELISA analysis against Adalim*mab, the result shows that the batch variation among the tested samples is negligible. The batch-to-batch conformance is also good as displayed in cell based assay (Fig. 10).
Fig. 10 In the above ELISA analysis, three different lots of biotinylated hTNF-alpha (Cat. No. TNA-H82E3) were used detect immobilized Adalim*mab (0.5 ug/ml). The result showed that the batch variation among the tested samples is negligible.
Fig. 11 Recombinant biotinylated human TNF-alpha (Cat. No. TNA-H82E3) induces cytotoxicity effect on the WEH1-13VAR cells in the presence of the metabolic inhibitor actinomycin D. The EC50 for this effect is 0.029-0.052 ng/ml.
Authors: MacLeod DT et al.
Journal: Mol Ther 2017
Product: biotinylated Human CD19(Cat. No. CD9-H8259)
Application: Flow Cytometry
Authors: El Amrani M et al.
Journal: J Chromatogr A 2016
Product: biotinylated human recombinant TNF-alpha(Cat. No. TNA-H8211)
Application: ELISA
Authors: Kim Young Min et al.
Journal: United States Patent Application 20160136300 2016
Product: ErbB2(Cat. No. HE2-H822R)
Application: ELISA
Authors: Pooja Sabhachandani et al.
Journal: Microchimica Acta 2015
Product: biotinylated human TNF-α(Cat. No. TNA-H8211)
Application: Microsphere-based assay
Authors: YU et al.
Journal: United States Patent Application 20140155285 2014
Product: biotinylated TNFα(Cat. No. TNA-H8211)
Application: Flow Cytometry
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